QPCR
Principe
A partir d'une simple copie d'une séquence particulière d'acides nucléiques, cette séquence peut être spécifiquement amplifiée et détectée. La nature exponentielle de cette technique la rend attrayante pour des analyses quantitatives. Théoriquement, il existe une relation quantitative entre la quantité de la séquence cible de départ et la quantité du produit amplifié à n'importe quel cycle. En pratique, il n'est pas rare que les réactions de PCR en replica donnent des taux différents d'amplicons. Le développement de la PCR quantitative en temps réel a éliminé les variabilités traditionnelles associées à la PCR quantitative et permet la quantification du produit de la PCR de façon fiable et routinière.
Au début de la réaction PCR, les réactifs sont en excès mais en concentration assez faible afin d'éviter que la renaturation des amplicons n'entre en compétition avec l'hybridation des amorces. L'amplification est alors réalisée de façon constante à un taux exponentiel à l'aide d'une ADN polymérase thermostable. Après la phase exponentielle la réaction d'amplification entre dans une phase linéaire où le taux d'amplification devient extrêmement variable, même au niveau de replica d'un même échantillon, à cause d'une compétition entre la renaturation des amplicons et l'hybridation des amorces. Suit ensuite une phase plateau où le taux d'amplification décroît à près de zéro générant très peu d'amplicons.
Afin de recueillir des données quantitatives avec précision, chacun des échantillons doit être analysé dans sa phase exponentielle d'amplification qui est la phase la plus reproductible de la réaction de PCR. La PCR en temps réel fait donc le suivi de la fluorescence émise pendant la réaction avec un indicateur de la production des amplicons durant chaque cycle, à l'opposé de la PCR quantitative conventionnelle où les amplicons ne sont détectés qu'à la toute fin du processus.
La technologie de la PCR en remps réel est basée sur la détection et la quantification d'un reporter fluorescent. L'augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés durant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle où la première augmentation significative dans la quantité d'amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice originale cible.
Plusieurs instruments de PCR en temps réel sont présents sur le marché. Ces appareils utilisent généralement un système en tubes fermés et la quantification ne requiert aucune manipulation post-amplification, ce qui minimise ou élimine les problèmes de contamination par les amplicons suite à la réaction de PCR et réduit le temps d'analyse. Le processus complet est donc automatisé du début à la fin rendant ainsi la QPCR intéressante pour des applications d'analyses à grand échelle.
Au début de la réaction PCR, les réactifs sont en excès mais en concentration assez faible afin d'éviter que la renaturation des amplicons n'entre en compétition avec l'hybridation des amorces. L'amplification est alors réalisée de façon constante à un taux exponentiel à l'aide d'une ADN polymérase thermostable. Après la phase exponentielle la réaction d'amplification entre dans une phase linéaire où le taux d'amplification devient extrêmement variable, même au niveau de replica d'un même échantillon, à cause d'une compétition entre la renaturation des amplicons et l'hybridation des amorces. Suit ensuite une phase plateau où le taux d'amplification décroît à près de zéro générant très peu d'amplicons.
Afin de recueillir des données quantitatives avec précision, chacun des échantillons doit être analysé dans sa phase exponentielle d'amplification qui est la phase la plus reproductible de la réaction de PCR. La PCR en temps réel fait donc le suivi de la fluorescence émise pendant la réaction avec un indicateur de la production des amplicons durant chaque cycle, à l'opposé de la PCR quantitative conventionnelle où les amplicons ne sont détectés qu'à la toute fin du processus.
La technologie de la PCR en remps réel est basée sur la détection et la quantification d'un reporter fluorescent. L'augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés durant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle où la première augmentation significative dans la quantité d'amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice originale cible.
Plusieurs instruments de PCR en temps réel sont présents sur le marché. Ces appareils utilisent généralement un système en tubes fermés et la quantification ne requiert aucune manipulation post-amplification, ce qui minimise ou élimine les problèmes de contamination par les amplicons suite à la réaction de PCR et réduit le temps d'analyse. Le processus complet est donc automatisé du début à la fin rendant ainsi la QPCR intéressante pour des applications d'analyses à grand échelle.
Equipement
Robot Biomek NX (Beckman)
Ce robot est équipé :
Ce robot est équipé :
- d'une tête mobile à 96 canaux permettant de pipetter jusqu'à 96 échantillons simultanément,
- d'un bras rotationnel (gripper) permettant la saisie et le déplacement des plaques,
- d'un lecteur de codes barres pour la traçabilité des expériences,
- d'un agitateur,
- d'un système de filtration par aspiration.
Le Biomek NX offre une multitude d'applications notamment l'extraction d'ADN ou d'ARN à partir de cellules cultivées en plaques 96 puits, le dosage rapide de protéines, la distribution fiable et régulière d'échantillons de plaque à plaque ou de tube à plaque sans cross-contamination ou bien encore la purification de produits de PCR par filtration ou à l'aide d'un système paramagnetique.
Robot Biomek 3000 (Beckman)
Ce robot est équipé :
Ce robot est équipé :
- d'une tête mobile à 1 ou 8 canaux (volume maximal pipeté = 20 ul),
- d'un bras rotationnel (gripper) permettant la saisie et le déplacement des plaques,
- d'un lecteur de codes barres pour la traçabilité des expériences.
Le Biomek est capable de pipeter des échantillons depuis divers formats de contenants, tels que des tubes ou des plaques vers des destinations de type similaire ou variable.
LightCycler 480 (Roche)
Equipé de deux blocs et supports de plaques interchangeables, le LC480 est capable d'analyser du matériel génomique préparé soit en plaques 96 soit en plaques 384 puits.
Il peut donc être utilisé en analyse ponctuelle simple en plaque 96 puits ou bien couplé au robot Biomek 3000 pour des analyses de plaques 384 puits.
Tous les formats de QPCR sont utilisables sur le LC480 (SYBR Green, TaqMan, Roche UPL etc...)
En outre, la courbe de fusion à haute résolution (High Resolution Melting - HRM) est une nouvelle méthode permettant l'analyse des variations génétiques (SNPs, mutations, methylations) sur des produits de PCR en amont du séquençage. Cette méthode rapide et à faible coût peut représenter une réelle alternative aux méthodes utilisées actuellement comme la DGGE, SSCP ou la dHPLC.
Roche propose désormais sur le LC480 le module "Gene Scanning" associant un nouveau logiciel et un ensemble de réactifs permettant d'utiliser le système pour la détection de polymorphismes à haut débit.
Roche propose désormais sur le LC480 le module "Gene Scanning" associant un nouveau logiciel et un ensemble de réactifs permettant d'utiliser le système pour la détection de polymorphismes à haut débit.
Prestations
➔ Détail des tarifications
Pour chaque projet de recherche qui nous est soumis, nous réalisons une étude de coût et un devis correspondant. Ainsi les tarifs proposés sont calculés au cas par cas et peuvent varier d'une projet expérimental à un autre.
➔ Détail des tarifications
Références
E. Poitras et A. Houde, La PCR en temps réel: principes et applications, Biology & Biotechnology (2002) Vol.2, No 2, pp.2–11.
E. Poitras et A. Houde, La PCR en temps réel: principes et applications, Biology & Biotechnology (2002) Vol.2, No 2, pp.2–11.