LI-COR
Principe
Les systèmes d'imagerie utilisés pour l'analyse des Western Blot sont souvent décrits comme des méthodes 'quantitatives'. Même s'il est vrai que les instruments utilisés pour lire les blots utilisent le signal de manière quantitative, les données produites par ces systèmes peuvent être quantitatives seulement si le signal biochimique émis est proportionnel à la quantité d'échantillon sur le blot et ce de manière linéaire.
Historiquement, la plupart des méthode de détection protéique dans les applications de Western Blot utilisait la chemiluminescence avec soit une caméra CCD soit un film. La détection chemiluminescente a été la méthode la plus utilisée pour les analyses de Western blot du fait de sa supériorité en terme de sensibilité. La détection de chemiluminescence repose sur une réaction enzymatique qui produit de la lumière qui est détectée par une caméra CCD enregistrant les photons et capable d'afficher une image basée sur la quantité de lumière émise (une seconde méthode consiste a déposer la membrane sur un film qui pourra être développé ultérieurement en image). La réaction enzymatique utilisée pour produire la lumière est dynamique, c'est à dire qu'elle change constamment au cours du temps. Certains échantillons produisent ainsi une lumière vive pendant un laps de temps court tendis que d'autres produisent comparativement une lumière plus faible mais sur une période plus longue. C'est pourquoi les images doivent être obtenues à un instant t optimisé. Cette dépendance à la durée de l'émission du signal compromet la quantification et la fiabilité de celle-ci.
La détection de fluorescence en revanche est statique. La lumière émise lors de l'excitation d'un fluorochrome est constante. Ainsi la détection de fluorescence est une méthode plus précise et plus fiable pour mesurer les différences de signal produits par des anticorps marqués liés à des protéines sur un Western Blot. Les protéines peuvent être quantifiées de manière fiable parce que le signal émis par les différentes quantités de protéines sur les membranes sera mesuré dans un état statique comparé à la chemiluminescence où la lumière est émise dans un état dynamique.
Des anticorps secondaires marqués avec des fluorophores émettant dans des longueurs d'onde du visible ont historiquement été utilisés pour les applications en Western-blot. Cependant leur performance est relativement moyenne et c'est pourquoi de nouveaux fluorophores ont été mis au point. Ces fluorophores ont la particularité d'émettre dans le proche infrarouge (NIR) ou l'infrarouge (IR) tels que les LI-COR IRDye® Infrared Dyes ce qui permet ainsi d'obtenir une excellente sensibilité associée à tous les avantages liés à l'utilisation de la fluorescence.
Historiquement, la plupart des méthode de détection protéique dans les applications de Western Blot utilisait la chemiluminescence avec soit une caméra CCD soit un film. La détection chemiluminescente a été la méthode la plus utilisée pour les analyses de Western blot du fait de sa supériorité en terme de sensibilité. La détection de chemiluminescence repose sur une réaction enzymatique qui produit de la lumière qui est détectée par une caméra CCD enregistrant les photons et capable d'afficher une image basée sur la quantité de lumière émise (une seconde méthode consiste a déposer la membrane sur un film qui pourra être développé ultérieurement en image). La réaction enzymatique utilisée pour produire la lumière est dynamique, c'est à dire qu'elle change constamment au cours du temps. Certains échantillons produisent ainsi une lumière vive pendant un laps de temps court tendis que d'autres produisent comparativement une lumière plus faible mais sur une période plus longue. C'est pourquoi les images doivent être obtenues à un instant t optimisé. Cette dépendance à la durée de l'émission du signal compromet la quantification et la fiabilité de celle-ci.
La détection de fluorescence en revanche est statique. La lumière émise lors de l'excitation d'un fluorochrome est constante. Ainsi la détection de fluorescence est une méthode plus précise et plus fiable pour mesurer les différences de signal produits par des anticorps marqués liés à des protéines sur un Western Blot. Les protéines peuvent être quantifiées de manière fiable parce que le signal émis par les différentes quantités de protéines sur les membranes sera mesuré dans un état statique comparé à la chemiluminescence où la lumière est émise dans un état dynamique.
Des anticorps secondaires marqués avec des fluorophores émettant dans des longueurs d'onde du visible ont historiquement été utilisés pour les applications en Western-blot. Cependant leur performance est relativement moyenne et c'est pourquoi de nouveaux fluorophores ont été mis au point. Ces fluorophores ont la particularité d'émettre dans le proche infrarouge (NIR) ou l'infrarouge (IR) tels que les LI-COR IRDye® Infrared Dyes ce qui permet ainsi d'obtenir une excellente sensibilité associée à tous les avantages liés à l'utilisation de la fluorescence.
Equipement
LI-COR Odyssey
L'Odyssey® est un système d'imagerie dans l'Infrarouge (IR) et le proche infrarouge (NIR) qui permet d'analyser des supports expérimentaux multiples (gels de protéines ou d'ADN, Western-Blot, cultures cellulaires en plaques multi-puits etc...) avec une excellente sensibilité et peu de bruit de fond.
L'Odyssey® est un système d'imagerie dans l'Infrarouge (IR) et le proche infrarouge (NIR) qui permet d'analyser des supports expérimentaux multiples (gels de protéines ou d'ADN, Western-Blot, cultures cellulaires en plaques multi-puits etc...) avec une excellente sensibilité et peu de bruit de fond.
L'Odyssey ® présente de nombreux avantages par rapport aux autres systèmes d'imagerie existants :
La détection dans le NIR est plus sensible que celle de la fluorescence visible et elle est égale, voire supérieure, à la détection de chemiluminescence. A des longueurs d'ondes élevées (supérieures à 600 nm), la surfaces des membranes, et les biomolécules dégagent une auto-fluorescence non spécifique très largement réduite. Ainsi, des membranes PVDF et/ou en nitrocellulose ont beaucoup moins d'auto-fluorescence lorsqu'elles sont scannées dans le NIR comparativement au spectre visible. De ce fait on obtient un signal de bruit de fond très amoindri et une meilleure qualité d'image.
Les révélations sont basées sur des réactions fluorescentes et non pas enzymatiques, l'Odyssey ® offre ainsi une plus large gamme linéaire dynamique permettant de détecter à la fois des signaux faibles et forts sur un même Western-blot.
L'utilisation simultanée de deux types d'anticorps primaires et de deux anticorps fluorescents secondaires différents, permet de détecter deux cibles sur une même membrane, un même gel ce qui augmente la précision de la quantification et ce qui améliore la qualité des comparaisons.
L'Odyssey ® est un système d'imagerie très commode qui ne nécessite pas l'utilisation de films, de chambre noire, d'emballages plastifiés spécifiques ou de substrats. Les fluorochromes IRDye par exemple ont une émission stable et peuvent donc émettre relativement longtemps à partir du moment où ils sont conservés dans de bonnes conditions.
Les applications possibles sur l'Odyssey sont multiples. Outre les traditionnels visualisations de Western-blot sur membrane PVDF ou nitrocellulose, cet appareil permet la visualisation et quantification des marquages (simples ou doubles) directement sur gel (In-Gel Western-blot) ou bien directement dans des cellules (In-Cell Western Assay) ou encore in-vivo dans des modèles animaux.
- il est plus sensible,
- il possède une très large gamme de détection linéaire,
- il permet la détection et la quantification en 2 couleurs,
- il est facile d'utilisation,
- il permet une multitudes d'applications expérimentales.
La détection dans le NIR est plus sensible que celle de la fluorescence visible et elle est égale, voire supérieure, à la détection de chemiluminescence. A des longueurs d'ondes élevées (supérieures à 600 nm), la surfaces des membranes, et les biomolécules dégagent une auto-fluorescence non spécifique très largement réduite. Ainsi, des membranes PVDF et/ou en nitrocellulose ont beaucoup moins d'auto-fluorescence lorsqu'elles sont scannées dans le NIR comparativement au spectre visible. De ce fait on obtient un signal de bruit de fond très amoindri et une meilleure qualité d'image.
Les révélations sont basées sur des réactions fluorescentes et non pas enzymatiques, l'Odyssey ® offre ainsi une plus large gamme linéaire dynamique permettant de détecter à la fois des signaux faibles et forts sur un même Western-blot.
L'utilisation simultanée de deux types d'anticorps primaires et de deux anticorps fluorescents secondaires différents, permet de détecter deux cibles sur une même membrane, un même gel ce qui augmente la précision de la quantification et ce qui améliore la qualité des comparaisons.
L'Odyssey ® est un système d'imagerie très commode qui ne nécessite pas l'utilisation de films, de chambre noire, d'emballages plastifiés spécifiques ou de substrats. Les fluorochromes IRDye par exemple ont une émission stable et peuvent donc émettre relativement longtemps à partir du moment où ils sont conservés dans de bonnes conditions.
Les applications possibles sur l'Odyssey sont multiples. Outre les traditionnels visualisations de Western-blot sur membrane PVDF ou nitrocellulose, cet appareil permet la visualisation et quantification des marquages (simples ou doubles) directement sur gel (In-Gel Western-blot) ou bien directement dans des cellules (In-Cell Western Assay) ou encore in-vivo dans des modèles animaux.
Prestations
L'Odyssey est en utilisation libre et l'IFR ne facture aucune prestation.
Toute personne souhaitant utiliser le scanner doit prévenir les ingénieurs de la plate-forme par téléphone (contact) ou par email (Laurence Louis et Elise Termine) au minimum 24h avant le jour prévu.
Les ingénieurs réserveront alors un créneau horaire pour l'utilisateur en fonction des disponibilités du scanner (agenda de réservation LICOR).
Toute personne souhaitant utiliser le scanner doit prévenir les ingénieurs de la plate-forme par téléphone (contact) ou par email (Laurence Louis et Elise Termine) au minimum 24h avant le jour prévu.
Les ingénieurs réserveront alors un créneau horaire pour l'utilisateur en fonction des disponibilités du scanner (agenda de réservation LICOR).
Références
Improving Quantification Accuracy for Western Blots, Bioscience Technology (Sept. 2006) Vol.31, No 8, pp.33–36.